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本制品是一种由高质量的次氮基三乙酸(NTA)共价偶联至琼脂糖磁珠，再通过NTA的4个结合位点螯合三价铁离子(Fe³⁺)制备而成的琼脂糖磁珠。本制品可特异性地与动植物或者微生物裂解液、血清、腹水、蛋白消化液、冻干多肽等样品中磷酸化多肽结合，从而用于磷酸化多肽或磷酸化多肽复合物的高效纯化。

BalbMag磷酸化多肽纯化琼脂糖磁珠(NTA-Fe)可特异性地结合磷酸化多肽，并可以借助磁力架等磁分离设备非常便捷地应用于磷酸化多肽或其多肽复合物的纯化等实验。本制品基于固定化金属离子亲和层析(IMAC)技术研发而成。研究发现，二价金属离子如铜离子、锌离子和镍离子可用于His-tag蛋白的分离纯化，而三价铁离子和四价钛离子可用于磷酸化蛋白和磷酸化多肽的富集和纯化。本制品的NTA-Fe琼脂糖磁珠能高效且快速地进行磷酸化多肽的富集和纯化，多肽纯化步骤简便，纯化条件温和，且多肽纯化后可直接进行下游实验。

• 稳定性高、特异性强、靶多肽结合量高：与国内外大多数的同类产品相比，本制品铁离子配基密度较高，铁离子脱落程度低，对磷酸化多肽的结合具有很强的特异性。本制品每毫升 悬浊液含约25%琼脂糖磁珠沉淀，含有不少于30μmol/mL的NTA-Fe³⁺，通常每毫升 琼脂糖磁珠沉淀可结合>4mg磷酸化多肽，具体的最大结合量和磷酸化多肽的分子量大小等相关。
  
• 结合目的多肽速度快：本制品使用了NTA螯合的铁离子，粒径在100μm左右。通常30分钟内即可完成磷酸化多肽吸附的过程，45分钟内完成目的多肽的纯化操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的多肽的降解或变性，充分保证目的多肽的活性。
  
• 可高效洗脱磷酸化多肽：本制品根据磷酸化多肽的结构、生物学功能及后续应用的要求等，使用5%氨水进行多次洗脱。洗脱时间短，洗脱效率高。
  
• 使用便捷：本制品储存在特殊保护液中，不含甘油，可以通过磁性吸附实现快速高效的分离，无需离心操作。

磷酸化蛋白是研究最多的一种蛋白质翻译后修饰，蛋白质的磷酸化和去磷酸化对生物体的众多生命活动起着至关重要的作用。质谱分析可精确鉴定蛋白质中发生的磷酸化修饰，并定位到具体的氨基酸残基，是磷酸化蛋白组学研究的核心技术。在进行质谱分析前，需要将蛋白质直接酶解成片段，但是这样的操作不仅增加了样品的复杂度，并且由于酶解后大量非磷酸化肽段抑制磷酸化肽段的质谱信号从而降低了磷酸化肽段的质谱检测灵敏度。因此，在质谱分析前对磷酸化蛋白或多肽进行有效的分离富集非常重要。

• 本NTA-Fe琼脂糖磁珠经测试，冻融3次不影响效价，但仍建议适当分装减少冻融次数。频繁使用建议4℃保存。
  
• 推荐纯化的磷酸化多肽来自冻干的多肽，且不含有变性剂和盐类，同时推荐使用Binding/Wash Buffer溶解冻干的磷酸化多肽以获得最优的纯化效果。
  
• 本制品纯化时不可以使用磷酸盐类缓冲液，以免和磷酸化多肽形成竞争结合，从而降低磷酸化多肽的载量。
  
• 本制品需维持pH为6～8，避免高速离心、干燥；请勿长时间将磁珠置于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。
  
• 本制品使用过程中，缓冲试剂如Tris、HEPES、MOPS等的浓度不宜超过100mM，Triton、Tween、NP-40的浓度不宜超过2%，脱氧胆酸钠、CHAPS的浓度不宜超过1%。其它未提及试剂的兼容性可以参考上述试剂，但有待实验验证。
  
• 本制品使用前要适当充分重悬，即颠倒若干次使磁珠混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡。
  
• 在纯化时，建议设置阳性和阴性对照组。
  
• 多肽样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓多肽降解或变性。为有效抑制多肽降解，可以在多肽样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，但不要添加EDTA。例如通用型蛋白酶抑制剂混合物、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)、哺乳动物样品专用蛋白酶抑制剂混合物、哺乳动物样品专用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物等。
  
• 如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。
  
• 0.1%的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。
  
• 如果自行配制裂解液，需注意DTT、TCEP、巯基乙醇和EDTA等对本制品与磷酸化多肽的结合可能有一定影响，但Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)或RIPA裂解液(强，无抑制剂)等都完全适用。

• 缓冲液的准备：
  
  • Binding/Wash Buffer：80%乙腈，0.1%三氟乙酸
    
  • Elution Buffer：5% NH₄OH
  • 所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm孔径滤膜过滤，以减少杂质，提高磷酸化多肽纯化效率。
  • 推荐的缓冲液适用于大多数磷酸化多肽的纯化。对于特殊样品，需自行进行适当的优化或参考常见问题。
• 样品的制备：
  
  • 使用Binding/Wash Buffer溶解冻干的磷酸化多肽，终浓度为2mg/mL。推荐使用低吸附离心管。
    
    • 为了得到最优的纯化结果，冻干的多肽必须完全溶解在Binding/Wash Buffer里。
  • (选做)使用pH试纸测试磷酸化多肽溶液的pH值，确保pH<3。
• 简称NTA-Fe磁珠的准备：
  
  • 用移液器轻轻吹打重悬NTA-Fe磁珠，按照每1mg目标多肽需要使用1mL磁珠悬浊液的用量，取适量NTA-Fe磁珠至一洁净低吸附离心管中，磁性分离去除上清；加入与原磁珠悬浊液等体积或适当更大体积的Binding/Wash Buffer洗涤磁珠。
    
  • 用移液器轻轻吹打重悬NTA-Fe磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
    
    • 为了减少磁珠的损耗，待溶液澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁力架上，按住离心管上下翻转数次，使澄清的溶液洗涤离心管盖子上残留的磁珠，静置后使溶液变澄清。以下同。
• 目标多肽与磁珠结合：
  
  • 加入磁珠与孵育：按照每1mg目标多肽样品，加入1mL磁珠悬浊液的比例加入NTA-Fe磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育30分钟。
    
    • 如果需要，可以在2～8℃旋转混合1小时，以防止目标多肽降解。
  • 磁分离：孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。
    
    • 对于上清部分，可适量保存并用于检测纯化的效果。
  • 洗涤：加入1mL的Binding/Wash Buffer，用移液器轻轻吹打重悬NTA-Fe磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。再用1mL质谱级水洗涤一次。
• 洗脱：
  
  • 根据目标多肽的浓度及后续实验要求，可以加入0.2～1mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，摇床摇动洗脱5分钟，磁性分离，收集洗脱液到新的低吸附离心管，即为纯化的磷酸化多肽。
    
  • 如果需要，重复上述步骤2～3次，收集样品到新的低吸附离心管中，还可以得到一些磷酸化多肽。
    
  • 合并洗脱的多肽样品，转移到低吸附离心管，真空蒸发旋干以用于LC-MS等分析。
    
    • 为了避免磁珠的残留，推荐洗脱液真空旋干前，10000×g离心1分钟取上清；或者推荐使用过柱以避免磁珠干扰LC-MS分析。
  • 使用0.1%甲酸(FA)重悬磷酸化多肽样品以用于LC-MS等分析。